生物选修一知识点整理(2)

生物选修一知识点整理

　　(2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理

　　当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

　　采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数

　　2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC(在计数琼脂中加入适量的TTC(0.5% TTC 1ML加到100ML琼脂中),细菌菌落长成红颜色,对去除食品本底颗粒物干扰非常有意义).

　　3.本法仅限于形成菌落的微生物

　　设置对照

　　设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。

　　实验设计

　　实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。

　　(1)土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。

　　(2)样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30~300之间、适于计数的平板。

　　测定土壤中细菌的数量，一般选用104 105 106

　　测定放线菌的数量，一般选用103 104 105

　　测定真菌的数量，一般选用102 103 104

　　(3)微生物的培养与观察

　　不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌30~37℃ 1~2天

　　放线菌25~28℃ 5~7天 霉菌25~28℃ 3~4天

　　每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。形状、大小、隆起程度、颜色

　　疑难解答

　　(1)如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数?

　　统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值

　　每克样品中的菌落数=(C/V)*M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数

　　课题三 分解纤维素的微生物的分离

　　纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。

　　纤维素与纤维素酶

　　(1)棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

　　(2)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。

　　纤维素分解菌的筛选

　　(1)筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。

　　(2)刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理

　　刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

　　分离分解纤维素的微生物的实验流程

　　土壤取样→选择培养(此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定)→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落

　　(1)土壤采集 选择富含纤维素的环境。

　　(2)刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤 倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板

　　(3)刚果红染色法种类

　　一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。

　　课题延伸

　　对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

　　疑难解答

　　(1)为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌?

　　由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

　　(2)将滤纸埋在土壤中有什么作用?你认为滤纸应该埋进土壤多深?

　　将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。

　　(3)两种刚果红染色法的比较

　　方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂;其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

　　(4)为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物?

　　在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。